SEQUENCAGE EN PLAQUE 96 PUITS

Culture ON
LR-PCR avec le Kit Expand Long Template PCR System
Traitement Exonucléase I/Schrimp Alkaline Phosphatase
Réactions de séquences
Ethanol précipitation

Culture ON

A partir d’une plaque 96 puits de la banque, ensemencer 2 boites de   LBAT + Amp (100 µg/mL). Déposer 48 échantillons par boite.
Incuber ON à 37°C.
 

LR-PCR avec le Kit Expand Long Template PCR System (Boehringer)

Manipulation dans la glace (4°C).
Dans une plaque de 96 puits, mettre 15µL d’eau/tube
Inoculer les tubes avec les colonies de la culture ON.
Ajouter dans chaque puits :

- 2,5 µL de tampon n°1 (10X).
- 2 µL du mélange de dNTP (10mM). 
- 0,1 µL de –21M13 Forward primer (100 µM). 
- 0,1 µL de M13 Reverse primer (100 µM).
- 0,5 µL d’enzyme : DNA pol mix (3,5 U/µL)
- 4,8 µL H2O
___________

10 µL + 15 µL sup. bactérienne = 25 µL réactionnel.
 

 Lancer le programme PCR n°150 : LR-PCR ON

# 150 :

- 94°C – 5’
- {94°C – 10’’/ 55°C – 10’’/65°C – 12’}x12
- { 94°C – 10’’/55°C – 10’’/65°C – 12’ + 0,15’}x24
- 72°C – 10’’
- 4°C – inf.

Puis vérifier sur gel agarose 0,8% + BET
Mettre 5 µL d’ADN de la LR-PCR + 2 µL de bleu
Faire des dépôts de 5 µL.
 

M13 Forward primer : 5’ – TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’.
M13 Reverse primer : 5’ – CAG GAA ACA GCT ATG ACC – 3’.

 Traitement Exonucléase I/Schrimp Alkaline Phosphatase
  Transférer 2 µL de chaque puits LR-PCR dans une nouvelle plaque 96 puits.
Ajouter dans chaque puits : - 1 µL de tampon phosphatase (10X). 100 µL par plaque
- 0,2 µL Exonucléase I (USB, 10 U/µL).  20 µL par plaque
- 0,1 µL Phosphatase ( USB, 1 U/µL). 10 µL par plaque
- 6,7 µL H2O. 670 µL par plaque
____________

8 µL + 2 µL DNA = 10 µL réactionnel.

 Lancer le programme PCR n°113 :
# 113 : Réactions de séquences Diviser la plaque de 96 puits avec 10 µL/puits en 2 plaques de 96 puits avec 5 µL/puits. (1 plaque pour les réactions directes et 1 plaque pour les réactions reverses).

Dans la plaque de réactions directes, ajouter dans chaque puits :
- 1 µL de –21M13 Forward primer (100 µM).
- 4 µL de DNA Sequencing Kit Big Dye.
- 10 µL H2O.
 15 µL + 5 µL DNA = 20 µL réactionnel.

Dans la plaque de réactions reverses, ajouter dans chaque puits :

- 1 µL de M13 Reverse primer (100 µM).
- 4 µL de DNA Sequencing Kit Big Dye.
- 10 µL H2O.

Total:15 µL + 5 µL DNA = 20 µL réactionnel.

 Lancer le programme n°39 :
# 39 : Garder les échantillons au maximum 48h00 à 4°C.

Ethanol précipitation :
 

Ajouter dans chaque puits 80 µL d’une solution EtOH/MgCl2 (1mL EtOH 70% + 0,5 µL MgCl2 1M). Pour les 2 plaques : 10 µL MgCl2 1M + 20 mL EtOH 70%.
Laisser 20’ à température ambiante.
Centrifuger 30’ à 4000 rpm à température ambiante.
Eliminer le surnageant en tapotant, puis en centrifugeant la plaque à l'envers 1' à 700 rpm.
Laver le culot avec 80 µL EtOH 70%.
Centrifuger 30’ à 4000 rpm à température ambiante.
Eliminer le surnageant en tapotant, puis en centrifugeant la plaque à l'envers 1' à 700 rpm.
Sécher.
Garder les plaques à –20°C. Préparation des plaques pour le séquençage :
 

Reprendre les culots avec 2 µL de bleu de séquence

Chauffer 2’ à 94°C, puis mettre dans la glace. ( PCR programme n°1. Couper au bout de 2’).
Déposer sur gel de séquence.