Protocole de PCR Multiplex

Protocole de PCR Multiplex

Dilution des Oligonucléotides
Préparation de la plaque de PCR multiplex avec 48 oligos par puits
LR-PCR avec les couples d'oligos choisis:
Traitement Exonucléase I /Shrimp Alkaline Phosphatase
Traitement Exo I /Shrimp Phosphatase dans une plaque 96 puits
Ethanol précipitation

Dilution des Oligonucléotides:

- Diluer les oligos en plaques de culture de 96 puits, à la concentration finale de 10 µM avec un volume final d'au moins 50 µL.
- Couvrir la plaque et la conserver à -20°C.

Préparation de la plaque de PCR multiplex avec 48 oligos par puits:

A partir de la plaque d'oligos dilués, préparer une plaque de PCR de 96 puits.
- Prendre le 1^er oligo et distribuer 1 µL dans les 48 premiers puits de la plaque.
- Prendre le 2^ème oligo et distribuer 1 µL dans le 2^ème puits et dans les 47 puits suivants.
- Prendre le 3^ème oligo et distribuer 1 µL dans le 3^ème puits et dans les 47 puits suivants.
- Prendre le n^ème oligo et distribuer 1 µL dans le n^ème puits et dans les 47 puits suivants.

- Pour le 50^ème oligo, distribuer 1 µL dans le 50^ème puits et dans les 47 puits suivants en recommençant au début de la plaque : lorque l'on arrive au dernier puits de la plaque, continuer en distribuant dans le puits n°1, puis n°2 et ainsi de suite .

- Faire ce travail jusqu'au dernier oligo. On aura ainsi 48 oligos par puits.

- Placer ensuite la plaque dans la glace.

Une représentation schématique de la plaque est présentée en dernière page.

Ajout du mélange nécessaire à la LR-PCR:

Cette étape doit se faire dans la glace.

- Ajouter dans chaque puits: - 6 µL tampon n°1 (10X).
- 0,1 µL de chromosome.
- 5 µL du mélange de dNTP (10mM).
- » 0,5 µL de DNA pol mix (3,5 U/µL) soit 2U par puits (1 tube d'enzyme pour la plaque entière).

- » 12 µL de mix + 48 µL d'oligos = 60 µL réactionnel.

Laisser la plaque dans la glace et lancer le programme PCR de Long Range PCR:
# 61: - 94°C – 5' - {94°C – 10'' /- 68°C – 12'} x 12 - {94° C – 10'' / 68°C – 12' + 0,15'} x 24

- 72°C – 10'
- 4°C – inf.

Vérifier le résultat sur gel d'agarose à 0,8% + BET.

Mettre 5 µL d’ADN de la LR-PCR + 2 µL de bleu
Faire des dépôts de 5 µL. Détermination des couples d'oligos responsables des différentes amplifications:

Pour déterminer le couple d'oligos responsable des différentes amplifications, il faut procéder de la façon suivante:

- pour une ligne de même amplification, prendre le premier et le dernier numéro de la ligne.
- on appelle N1 le premier numéro et N2 le dernier numéro.
- on appelle O1 l'oligo1 et O2 oligo 2.
- on appelle N le nombre d'oligo par puits et M le nombre total d'oligos utilisés dans la plaque

- on a alors la formule suivante:

- O1 = N1
- si N2>N, O2 = N2 – N + 1
- si N2<N, O2 = (N2 – N + 1) + M

exemple:

- si N = 48 et M = 96
- alors O1 = N1
- si N2>48, O2 = N2 – 48 + 1
- si N2<48, O2 = (N2 – 48 + 1) + 96.

Après avoir choisi les couples d'oligos responsables des différentes amplifications, refaire une LR-PCR pour vérifier que la taille des fragments est bien due aux oligos choisis.

LR-PCR avec les couples d'oligos choisis:

Manipuler dans la glace.
Mettre dans chaque puits:

- 2 µL d'oligo 1(10µM)
- 2 µL d'oligo 2 (10µM)
- 0,1 µL de chromosome
- 5 µL de tampon n°1 (10X)
- 4 µL du mélange de dNTP (10mM)
- » 0,5 µL de DNA pol mix (3,5U/µL) soit 2U par puits (1 tube d'enzyme pour la plaque entière).
- 36 µL d'H₂O. Lancer le programme PCR n°61

Vérifier le résultat sur gel d'agarose à 0,8% + BET.
Avec les résultats positifs, lancer le traitement Exonucléase puis les réactions de séquence.

Traitement Exonucléase I /Shrimp Phosphatase

Source des enzymes:
Exonucléase I: USB E70073Z 2500U 10u/ul
Shrimp Alkaline Phosphatase: 70092Z 1000U 1u/ul

Transférer 20 µL de chaque puits LR-PCR dans une nouvelle plaque 96 puits.

Ajouter dans chaque puits: - 1 µL Exonucléase I (10 U/µL).
- 0,5 µL Phosphatase (1 U/µL).
- 3,5 µL H₂O. ___________
5 µL + 20 µL DNA = 25 µL réactionnel. Lancer le programme PCR n°113:

# 113:

- 37°C – 60’
- 94°C – 5’
- 4°C – inf.

Traitement ExoI/ Shrimp Phosphatase en plaque 96 puits + Séquençage Diviser la plaque de 96 puits qui a subit le traitement exo/phosphatase (25 µL/puits) en 2 plaques de 96 puits avec 5 µL/puits. (1 plaque pour les réactions avec l'oligo 1 et 1 plaque pour les réactions avec l'oligo 2).

Dans la plaque de réactions avec l'oligo 1, ajouter dans chaque puits:

- 1 µL d'oligo 1 (10 µM)

- 4 µL de DNA Sequencing Kit Big Dye.
- 10 µL H₂O.
______________________________ 15 µL + 5 µL d'ADN = 20 µL réactionnel.

Dans la plaque de réactions avec l'oligo 2, ajouter dans chaque puits:

                            - 1 µL d'oligo 2 (10 µM) - 4 µL de DNA Sequencing Kit Big Dye.                             - 10 µL H₂O.
                            __________________________

                             15 µL + 5 µL d'ADN = 20 µL réactionnel. Lancer le PCR programme n°39:
# 39: - 96°C – 10’’
- 50°C – 4’’ X25
- 60°C – 4’

- 4°C – inf.

Ethanol précipitation:
Ajouter dans chaque puits 80 µL d’une solution EtOH/MgCl₂ (1mL EtOH 70% + 0,5 µL MgCl₂ 1M). Pour les 2 plaques: 10 µL MgCl₂ 1M + 20 mL EtOH 70%.
Laisser 20’ à température ambiante.
Centrifuger 30’ à 4000 rpm à 4°C.
Eliminer le surnageant en tapotant.
Laver le culot avec 80 µL EtOH 70%.
Centrifuger 30’ à 4000 rpm à 4°C.
Eliminer le surnageant.
Sécher.
Garder les plaques à –20°C. Reprendre les culots avec 2 µL de bleu de séquence.
Chauffer 2’ à 94°C, puis mettre dans la glace. ( PCR programme n°1. Couper au bout de 2’).
Déposer sur gel de séquence .